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Real-Time PCR预混液(染料法,含指示剂)图片
产品货号:
WH0107
中文名称:
Real-Time PCR预混液(染料法,含指示剂)
英文名称:
2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix
产品规格:
500T|5000T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价

Real-Time PCR预混液(染料法,含指示剂)是采用SYBR Green I嵌合荧光法进行Real-Time PCR的专用试剂。产品中预先混有Real-Time PCR反应所需合适浓度的SYBR Green I,是一种2×浓度的qPCR预混液。本制品额外添加了指示剂,利于大量样品的加样,减少误操作概率。



2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶(化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶),配合精心优化buffer体系,具有高扩增效率,高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。本升级版试剂在经过成分调整后,扩增特异性上的优势更为突出。




  • 2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶(化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶),从而构成酶活自动调节系统,配合精心优化buffer体系,具有高扩增效率,高扩增特异性和宽广的可信范围的特点。
  • 本制品Buffer体系平衡了K+和NH4+的比例,还特别添加了独特的H-Bond因子,能协同调整反应体系中的氢键作用力,使引物模板退火条件更加严谨,反应的专一性增强,重复性更好。
  • 2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix中预混有SYBR Green I,PCR反应液配制时,只需加入模板、引物、无RNA酶超纯水便可进行Real-Time PCR反应,操作简单方便。
  • 本制品附带ROX Reference Dye,用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差,方便客户针对不同型号荧光定量PCR仪时选择对应浓度使用。
  • 添加颜色指示剂,令加样更加简便,有效降低误操作概率。经过严格检测,指示剂不会影响染料的荧光值和定量结果。
    Real-Time PCR预混液颜色示意图



本制品采用了独特的双组分热启动DNA聚合酶进行PCR扩增,通过检测反应进程中SYBR Green I的荧光强度,达到检测PCR产物扩增量的目的。


本制品中双热启动酶构成了独特的酶活自动调节系统。酶活自动调节系统是由化学修饰的HotStar Taq DNA聚合酶和抗体修饰的Anti Taq DNA聚合酶组成。其中HotStar Taq DNA聚合酶占绝大部分比例,其聚合酶活性的激活是严格依赖于95℃高温的一个缓释过程,而Anti Taq DNA聚合酶则在95℃高温下完全激活。经过95℃条件下孵育15min激活大部分HotStarTaq DNA聚合酶,进入PCR循环后,每经过一轮95℃条件下变性,即可重新激活一部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶独特的酶活缓释机制使其可以与Anti Taq DNA聚合酶构成独特的酶活自动调节系统。PCR反应初期,完全激活的Anti Taq DNA聚合酶可以协同已经激活的HotStar Taq DNA聚合酶达到优化的酶活状态,而在整个PCR反应过程中,每一轮新释放的HotStart Taq DNA聚合酶活力刚好可以弥补因热变性所导致的部分酶活损失。因此,SuperReal SYBR Color qPCR Mix在整个PCR反应过程始终保持优良的DNA聚合酶活力,配合精心优化Buffer体系,从而可以获得高扩增效率,高扩增特异性和更加广泛性的模板适应性。




组分500T5000T
2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix4×1.25mL40×1.25mL
50×ROX Reference Dye1mL10×1mL
40×Dilution Buffer1.25mL10×1.25mL
RNase-Free ddH2O5×1mL50×1mL

保存:-20℃,有效期1年。


收到本制品后,请立即置于-30~-15℃避光保存。从-30~-15℃取出使用时,将冻存的2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix和50×ROX Reference Dye融解,然后轻轻颠倒混匀,待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用,须彻底混匀后重新冷冻(在解冻过程中盐会出现分层现象,未混匀进行冷冻,盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用,可在2~8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。




  • PCR反应液中各颜色指示剂的终浓度应为1×,请根据模板的添加量计算Dilution Buffer的用量。
  • PCR反应的预变性条件必须设定为95℃ 15min,用以充分激活热启动酶。
  • 本制品中含有荧光染料SYBR Green I,保存本制品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
  • 如果试剂没有混匀,其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀,请不要使用涡旋仪进行混匀,尽量避免出现泡沫,并经瞬时离心后使用。
  • 引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。如果需要进一步优化,可以在0.2~0.5μM范围内调整引物浓度。
  • 20μL反应体系中,基因组DNA或cDNA模板的使用量一般小于100ng,逆转录产物作为模板时,使用量应不超过PCR体系终体积的20%。



  • 建立Real-Time PCR反应体系
    • 解冻2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix、50×ROX Reference Dye、模板、引物、40×Dilution Buffer和RNase-Free ddH2O,并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
    • 建议置于冰上进行Real-Time PCR反应液的配制。
      40×Dilution Buffer为黄色,2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix为蓝色。如需稀释模板,则最终反应体系应为绿色;否则应为蓝色。如颜色不符,请检查体系中是否正确加入相关组分。
      成分50μL体系25μL体系20μL体系终浓度
      2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix25μL12.5μL10μL
      正向引物(10μM)1.5μL0.75μL0.6μL0.3μM
      反向引物(10μM)1.5μL0.75μL0.6μL0.3μM
      cDNA模板(含Dilution Buffer)-ng-pg
      50×ROX Reference Dye
      RNase-free ddH2O至50μL至25μL至20μL
      • 引物终浓度为0.3μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时,可增加PCR反应体系中的引物浓度;发生非特异扩增时,可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的,可以在0.2~0.5μM范围内调整。
      • 如需稀释模板,应先将cDNA模板与40×Dilution Buffer按一定比例混合成稀释模板。稀释比例如下:
        • 20μL反应体系中cDNA用量与40×Dilution Buffer含量对应表:
          20μL PCR体系中稀释
          模板的添加量(μL)
          122.53456
          稀释模板中Dilution
          Buffer的浓度
          20×10×6.7×3.3×
          100μL稀释模板中所需40×
          Dilution Buffer的量(μL)
          50252016.712.5108.4
          100μL稀释模板中所需
          cDNA的量(μL)
          50758083.387.59091.6
        • 50μL反应体系中cDNA用量与40×Dilution Buffer含量对应表:
          50μL PCR体系中稀释
          模板的添加量(μL)
          22.534568
          稀释模板中Dilution
          Buffer的浓度
          25×20×16.7×12.5×10×8.3×6.25×
          100μL稀释模板中所需40×
          Dilution Buffer的量(μL)
          62.55041.731.32520.815.6
          100μL稀释模板中所需
          cDNA的量(μL)
          37.55058.368.77579.284.4
      • 几种常见仪器的匹配ROX Reference Dye浓度见下表:
        仪器终浓度
        ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne等5×(例如5μL ROX/50μL体系)
        ABI 7500、7500 Fast;Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等1×(例如1μL ROX/50μL体系)
        Roche仪器,Bio-Rad仪器,Eppendorf仪器等无需添加
  • 进行Real-Time PCR反应
    • 建议采用两步法PCR反应程序进行反应。当出现模板浓度过低引起非特异扩增,引物Tm值较低导致的扩增效率低下或扩增曲线重现性不佳等现象时,建议尝试进行三步法PCR扩增反应。
      • 两步法反应程序:
        阶段循环温度时间内容荧光信号采集
        预变性195℃15min预变性
        PCR反应4095℃10sec变性
        60~66℃▲120~32sec▲3退火/延伸
        熔解曲线分析(Melting/Dissociation Curve Stage)
      • 三步法反应程序:
        阶段循环温度时间内容荧光信号采集
        预变性195℃15min预变性
        PCR反应 4095℃10sec变性
        50~60℃▲220sec退火
        72℃20~32sec▲3延伸
        熔解曲线分析(Melting/Dissociation Curve Stage)
      ▲1:请先使用60℃ 32sec (20sec,30sec,31sec.)进行扩增。如果需要进一步优化,可以尝试在60~66℃范围内进行。
      ▲2:通常引物退火温度比引物的解链温度(Tm)低5℃,如果引物碱基数较少,可以适当提高退火温度,这样可以使PCR的特异性增加;如果碱基数较多,那么可以适当减低退火温度。
      ▲3:使用不同仪器进行时间设定时,请按照仪器使用说明书要求进行实验操作,几种常见仪器的时间设定见下表:
      使用时Roche LightCycler/LightCycler 480请设定在20sec。
      使用ABI 7500 Fast/7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus时请设定在30sec。
      使用ABI 7000和7300时请设定在31sec。
      使用ABI 7500时请设定在32sec。
    • 盖上反应管,轻柔混匀。可短暂离心,确保所有组分均在管底。
    • 将反应体系置于荧光定量PCR仪中,开始反应。
      • 以使用ABI 7500 Real-Time PCR扩增仪为例,进行扩增效率优化时,可以按照下表中所示优化方案1或优化方案2的反应条件进行反应:
        基本反应程序优化方案1
        (增加两步法延伸时间进行优化)
        优化方案2
        (使用三步法进行PCR反应)
        195℃15min15min95℃15min
        4095℃10sec10sec95℃10sec
        60℃32sec32~60sec55℃30sec
        NA72℃32sec
      • 以使用ABI 7500 Real-Time PCR扩增仪为例,进行特异性优化的参考方案:
        基本反应程序特异性优化方案
        (提高两步法退火温度)
        循环温度时间温度时间
        195℃15min95℃15min
        4095℃10sec95℃10sec
        60℃32sec60~64℃32sec



进行RT-qPCR反应时的操作建议:

进行RT-PCR反应时,有三种cDNA第一链合成试剂盒可以选择,分别是反转录试剂盒cDNA第一链合成反应预混液(去除基因组DNA)cDNA第一链合成试剂盒。其中Quicking cDNA第一链合成试剂盒是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的,具有高灵敏度的RT-PCR反应系统,可以从微量的总RNA或poly (A)+ RNA合成第一链cDNA。该试剂盒中使用的逆转录酶King Reverse Transcriptase与通常使用的Moloney鼠白血病病毒来源的M-MLV和鸟成髓细胞病毒来源的AMV不同,是一种使用大肠杆菌工程菌进行重组表达的全新高效逆转录酶。该酶能够高效反转录多种RNA模板,高效地将RNA反转录成cDNA第一链。


反转录试剂盒为例,下列操作步骤适用于模板量为50ng~2μg的总RNA。


  • 将模板RNA在冰上解冻;5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×King RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室温(15~30℃)解冻,解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀,简短离心以收集残留在管壁的液体。
    • 以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应时,应先配制成Mix,然后再分装到每个反应管中。
  • 按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液,彻底混匀。简短离心,并置于42℃,孵育3min。然后置于冰上放置。
    表1:gDNA去除反应体系
    成分用量
    5×gDNA Buffer2μL
    Total RNA-
    RNase-Free ddH2O至10μL
  • 按照表2的反转录反应体系配制混合液。
    表2:反转录反应体系
    成分用量
    10×King RT Buffer2μL
    Quicking RT Enzyme Mix1μL
    FQ-RT Primer Mix2μL
    RNase-Free ddH2O至10μL
  • 将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中,充分混匀。
  • 42℃,孵育15min;95℃,孵育3min。
  • 进行PCR反应


本实验是应用两步法定量RT-PCR对人Jurkat cell的Hsc mRNA进行定量检测。荧光定量PCR是使用2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix。cDNA合成是使用反转录试剂盒进行,cDNA用量相当于100ng~10pg总RNA。扩增曲线(左图)和熔解曲线(右图)显示扩增效率和特异性良好。


Real-Time PCR预混液(染料法,含指示剂)


进行Real-Time PCR反应时,PCR引物的设计非常重要。设计PCR扩增效率高,反应特异性强的引物可以参考以下要求。
引物长度18~30个碱基
GC含量40~60%
Tm值引物软件都可以给出Tm,与引物长度,碱基组成,引物使用缓冲的离子强度也有关。
上下游引物的Tm值要尽量接近。
简单的Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)。
一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。
提高退火温度可以增加PCR反应的特异性。
引物及PCR扩增
产物序列
PCR扩增产物适宜长度在80~200bp之间。
尽量避开在模板的二级结构区域设计引物。
避免上下游引物3'端之间形成2个或以上的互补碱基以减少引物二聚体的形成。
引物3'端碱基不能有多于3个连续的G或C。
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构。
避免引物3'末端碱基为T。
引物序列中A、T、G、C要尽量均匀分布。



  • 无扩增信号或扩增曲线起峰晚或仅有引物二聚体
    原因解决办法
    DNA模板中存在抑制剂重新纯化模板或降低模板使用量
    Mg2+浓度不合适使用2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix时,PCR反应体系中Mg2+的终浓度为2mM。对有些扩增体系,可以将Mg2+终浓度提高到5mM。进行Mg2+终浓度优化时,建议每次增加0.5mM Mg2+浓度进行实验。
    加样错误或试剂问题检查试剂浓度和保存条件,包括所使用的引物和模板。重复进行实验。
    热启动酶未能激活使用试剂时,请确保预变性条件为95℃ 15min,用以有效激活热启动DNA聚合酶。
    PCR条件、引物序列或浓度不当请确认引物未发生降解,引物浓度及PCR条件,扩增不好时,通常先尝试降低退火温度,延长退火时间和提高引物浓度,有时也可以提高退火温度,增加延伸时间,降低升温速度。对于GC含量高的模板,可以适当延长变性时间。如果还是扩增不好,请重新设计引物。
    起始模板问题检查起始模板的浓度,保存条件和质量。重新对模板进行线性梯度稀释,并用新稀释模板进行实验。增加起始模板使用量。
  • NTC出现较高的荧光值
    原因解决办法
    试剂污染建议使用新试剂进行实验。
    PCR反应液配制时发生污染采取必要的防污染策略(如使用带滤芯的枪头)。
    引物出现降解可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况。
  • 出现引物二聚体和(或)非特异扩增
    原因解决办法
    Mg2+浓度不合适使用2×SuperReal SYBR Color qPCR Mix的反应体系含有Mg2+的终浓度为2mM。对有些扩增体系,可以将Mg2+终浓度增加到5mM。建议每次增加0.5mM Mg2+浓度进行优化。
    PCR退火温度太低建议每次增加2℃进行退火温度优化。
    引物设计不合适考虑重新设计引物序列。
    PCR产物太长荧光定量PCR产物长度最好在100~150bp之间,而且不应该超过500bp。
    引物出现降解可以使用变性聚丙烯酰胺胶检测引物降解情况。
    计量误差反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。
  • 定量值重现性差
    原因解决办法
    仪器方面的故障因为仪器的不适用,在温度管理或检测时产生重现性差。请根据相应仪器的说明书进行点检。
    样品纯度不好不纯的样品会导致实验的重现性差。
    稀释的模板放置太久通过梯度稀释的模板最好现配现用。
    引物质量下降尽量避免新合成引物批次间的差异,可以使用原来质量好的引物做为对照。
    PCR反应条件、引物浓度、序列等不恰当扩增效率差的PCR较容易产生重现性差。通过变更引物的度或PCR反应条件来进行调整。扩增不好时,一般可降低退火温度或提高引物浓度,也可以延长延伸时间。如模板的GC含量较高,可延长变性时间。仍得不到改善时,建议重新设计引物。
    计量误差反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。

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